造血干細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)步驟

1、胚胎成纖維細(xì)胞的復(fù)蘇：胚胎干細(xì)胞一般是在37℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)條件下，生長(zhǎng)在鋪有一層滋養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞培養(yǎng)皿或者是細(xì)胞培養(yǎng)瓶中（此處以細(xì)胞培養(yǎng)皿為例）。因此要先鋪?zhàn)甜B(yǎng)層細(xì)胞。在37℃水浴鍋里快速融化一管液氮凍存的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。把融化的細(xì)胞懸浮液加到裝有幾毫升預(yù)熱好的MEF培養(yǎng)基的無菌離心管中，輕輕混勻后，1000×g ，5min離心收集細(xì)胞。吸掉上清（除去凍存液中的DMSO），用10ml預(yù)熱的MEF培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，加到一個(gè)10cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放入37℃，含有5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)情況對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，大約4天左右，細(xì)胞就可以基本長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，這時(shí)可以進(jìn)行傳代、凍存或用于制備滋養(yǎng)細(xì)胞層。

2、滋養(yǎng)細(xì)胞層的制備：把長(zhǎng)好的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基吸掉，加入10ml新鮮的MEF培養(yǎng)基，并在避光的條件下加入110μl配好的絲裂霉素C，混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h。把含有絲裂霉素C的培養(yǎng)基用無菌的15ml離心管收集起來避光保存，在一周之內(nèi)可再次使用（直接使用該培養(yǎng)基處理細(xì)胞5h）。用PBS(不含二價(jià)離子)洗滌細(xì)胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱放置約3min，直到細(xì)胞懸浮起來。用1ml MEF培養(yǎng)基中和胰酶的作用，之后把細(xì)胞收集到離心管里，1000×g離心5min。去掉上清，用1ml MEF培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，之后把細(xì)胞平均分到兩個(gè)經(jīng)過0.1%明膠處理過的細(xì)胞培養(yǎng)皿

中，用MEF培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。（明膠處理：加5ml 0.1%的明膠到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在37℃培養(yǎng)箱中至少放置10min，之后把明膠吸掉即可）。一般處理好的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞在1~2h之后即可以貼壁，形成滋養(yǎng)細(xì)胞層，這時(shí)的滋養(yǎng)細(xì)胞層即可

用來培養(yǎng)小鼠胚胎干細(xì)胞。制備好的滋養(yǎng)細(xì)胞層可以在MEF培養(yǎng)基中保持1周左右的時(shí)間，或者是把細(xì)胞凍存。

3、小鼠胚胎干細(xì)胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的復(fù)蘇

4、小鼠胚胎干細(xì)胞的傳代

5、小鼠胚胎干細(xì)胞的凍存

造血干細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)注意事項(xiàng)：

1、絲裂霉素C在操作時(shí)要避光，避免其分解。

2、ES細(xì)胞傾向于聚集生長(zhǎng)，因此在復(fù)蘇時(shí)，要選擇好培養(yǎng)皿的規(guī)格

3、ES細(xì)胞不能長(zhǎng)的太滿，應(yīng)避免使各個(gè)克隆之間接觸，以免發(fā)上分化。

4、為避免水或血清帶來的污染，對(duì)血清應(yīng)進(jìn)行支原體檢測(cè)，配好的培養(yǎng)基要進(jìn)行污染測(cè)試。